2024
1) Изучено влияние экзогенных дцРНК, кодирующих четыре транскрипционных репрессора синтеза антоцианов томата Solanum lycopersicum, на экспрессию Проект № 23-26-00253 Страница 40 из 47 целевых генов и содержание антоцианов в 4-недельных растениях томата. Синтезированные дцРНК кодируют SlMyb76, SlMyb32, SlMybATV и SlTRY (семейство транскрипционных факторов MYB). Экзогенное применение геноспецифичных дцРНК значительно снижало уровни мРНК целевых генов и, в тоже время, значительно повышало содержание антоцианов и экспрессию генов их биосинтеза. Это позволило повысить уровень антоцианов в листьях томатов с 0,17 до 1,2-3,1 мг/г сырой массы, что явилось значительным увеличением. При этом неспецифичные NPTII-дцРНК не оказывали значимого эффекта. Таким образом, экзогенные геноспецифичные дцРНК могут индуцировать посттранскрипционный сайленсинг генов у томата путем прямой обработки листьев без дополнительных вспомогательных агентов. Этот подход может быть использован для регуляции вторичного метаболизма растений. Кроме того, настоящая работа показывает, что четыре проанализированных гена MYB действительно являются негативными регуляторами биосинтеза антоцианов. Опубликована статья (Suprun et al. 2023 IJMS). 2) Показано, что экзогенное нанесение AtCHS-дцРНК на розеточные листья A. thaliana вызывало значительные количественные и качественные изменения в профиле микроРНК, в то время как NPTII-дцРНК оказывала минимальное влияние. Через два дня после нанесения дцРНК мы детектировали 60 дифференциально экспрессируемых микроРНК из 428 обнаруженных микроРНК. 59 микроРНК были значительно изменены после обработки AtCHS-dsRNA по сравнению с водой и NPTII-dsRNA, и 1 микроРНК была значительно изменена после обработки AtCHS-dsRNA и NPTII-dsRNA по сравнению с водой. Экспрессия 35 микроРНК снижалась под воздействием AtCHS-дцРНК, а 24 микроРНК, наоборот, были активированы под воздействием AtCHS-дцРНК. Подтверждены несколько предсказанных генов-мишеней для дифференциально экспрессированных микроРНК, включая гены APETALA2, SCL27, SOD1, GRF1, AGO2, PHB и PHV. Анализ показал отрицательную корреляцию между экспрессией микроРНК и экспрессией их предполагаемых мишеней. Таким образом, экзогенные дцРНК, специфичные для генов растений, вызывают существенные изменения в общем профиле микроРНК растения, что в конечном итоге влияет на экспрессию широкого спектра генов. Опубликована статья (Nityagovsky et al. 2024 Plants). 3) Показано, что одновременное нанесение на листья арабидопсиса пяти геноспецифичных дцРНК в смеси значительно снижало экспрессию генов-мишеней AtANAC032, AtCBP60g, AtCPC, AtMYBL2 и AtBAN для арабидопсиса, и четырех геноспецифичных дцРНК в смеси – значительно снижало экспрессию генов-мишеней томата SlMyb76, SlMyb32, SlMybATV и SlTRY и значительно активировало накопление антоцианов в 2-3 раза, до 0,3 мг/г сырой массы. Обнаружено, что применение дцРНК в смесях активировало накопление антоцианов более эффективно, чем любая из этих дцРНК по отдельности. Неспецифическая NPTII[1]дцРНК существенно не влияла на уровни экспрессии генов-мишеней и содержание антоцианов, что указывает на специфичность эффектов сайленсинга генов. Полученные данные важны для биотехнологии растений и исследования функций растительных генов. Опубликована статья (Kiselev et al. 2024 Plants). 4) Проанализирован уровень метилирования ДНК по цитозину гена AtCHS A. thaliana с помощью бисульфитного секвенирования после экзогенной обработки растений растворами дцРНК. Оценивали уровень метилирования ДНК, соответствующей тому же участку, под который подбирали AtCHS-дцРНК для экзогенной обработки растений (3’-концевая область гена 292 пн). В стандартных условиях обработка растений как AtCHS-дцРНК, так и NPTII-дцРНК не оказывала значительного влияния на общий уровень метилирования по цитозину гена AtCHS по сравнению с водой. Однако, совершенно другая картина наблюдалась под воздействием антоциан-индуцирующих стрессовых условий. В этом случае уровень метилирования гена AtCHS значительно снижался во всех пробах, особенно в контроле (вода) 61%, по сравнению с контрольными условиями, но это снижение было значительно менее выраженном при обработке растений AtCHS-дцРНК (88%) и NPTII-дцРНК (75%). Наиболее выраженное сдерживание падения метилирования было под воздействием AtCHS-дцРНК (88%). Анализ распределения метилирования ДНК по сайтам метилирования (CG, CHG, CHH) показал, что AtCHS-дцРНК и NPTII-дцРНК не оказывают существенного влияния. 5) Из более ранних наших работ известно, что VaMyb1 в винограде амурском является транскрипционным фактором-блокатором биосинтеза стильбенов. Проведен анализ эффективности сайленсинга гена VaMyb1 как in vitro (в каллусных культурах клеток), так и in vivo в листьях отрезков лианы винограда амурского V. amurensis. Показано, что экзогенные VaMyb1-дцРНК приводят к увеличению уровня содержания стильбенов в V. amurensis через ингибирование экспрессии гена VaMyb1, но в целом обработка культур клеток V. amurensis дцРНК против гена VaMyb1 дала небольшой положительный эффект. Обработка каллусов VaMyb1- дцРНК снижала экспрессию гена VaMyb1 и содержание стильбенов до 1.3 и 1.2 раз, соответственно. Содержание стильбенов возрастало с 2.1 до 4.9 мг/г сухой биомассы, что является относительно небольшим стимулирующим эффектом. Более интересные результаты показала обработка листьев лианы винограда дцРНК против гена VaMyb1. В отличие от эксперимента с культурами клеток эффект уменьшения уровня экспрессии гена VaMyb1 наблюдался как на 3-й, так и на 7-й день после обработки. Уменьшение уровня экспрессии VaMyb1 в листе, обработанном дцРНК, также было и на необработанном участке листа. 6) Проведена оценка влияния экзогенных SlTRY-дцРНК, кодирующих различные области гена-мишени SlTRY томата S. lycopersicum (промоторную, белок-кодирующую и интронную), на экспрессию гена-мишени и биосинтез антоцианов. Анализ экспрессии гена SlTRY под воздействием дцРНК-Prom1 (кодирует промотор), дцРНК-Prom2 (промотор и начало кодирующей области), дцРНК-Intr (интрон) и дцРНК-TRY (кодирующая область) продемонстрировало критическую важность выбора соответствующей области гена-мишени для воздействия экзогенными дцРНК на растение. Наибольшее ингибирование экспрессии гена SlTRY, активация генов биосинтеза из фенилпропаноидного пути и активация биосинтеза антоцианов были достигнуты с помощью дцРНК, комплементарной белок-кодирующей области гена SlTRY. Подавление гена SlTRY увеличивало содержание антоцианов и повышало уровень других веществ фенилпропаноидного пути. Интересно, что дцРНК-Intr (интрон), наоборот, активировала экспрессию гена SlTRY, не влияя при этом на содержание антоцианов. Опубликована статья (Suprun et al. 2024 Plants).
