2008
Номер проекта: 06-04-48969-а Название проекта: Исследование роли хромосомной изменчивости в процессе видообразования у серых полевок Microtus, лесных и полевых мышей Apodemus (Rodentia, Muridae) Коды классификатора, соответствующие содержанию фактически проделанной работы 04-150 04-260 04-140 04-100 Объявленные ранее цели проекта на 2008 год: кариологически и генетически исследованы полевки Мicrotus gregalis в Амурской области, т.к. в северо-восточной части ареала этого вида полевки. Будет описан новый вид серых полевок из Хабаровского края - M. gromovi; • проведен анализ хромосомных форм M. maximoviczii; • проведено дифференциальное ккрашивание трех видов рода Мicrotus: M. mandarinus, M. mujanensis (Бурятии) и M. maximoviczii (Читинская обл.). • построено филогенетическое дерево видов серых полевок Забайкалья и ДВ России; завершен анализ данных мтДНК видов серых полевок северо-востока Российского ДВ; завершен анализ данных мтДНК видов рода Apodemus и популяций европейской и азиатской частей ареала A. agrarius. • проведен FISH анализ В-хромосом A. peninsulae из популяций Бурятии (отлов 2007 г.) и характер изменчивости ДНК добавочных хромосом в популяциях России: Сибири, Забайкалья, Хабаровского края, Приморья, Сахалина, а также Кореи и Японии; Завершен анализ: • С-окраски и FISH из различных географических популяций для S. uralensis; • характера мозаицизма, обусловленного изменчивостью числа и морфологии В-хромосом в популяциях ДВ России восточноазиатской мыши. Степень выполнения поставленных в проекте задач: Все задачи проекта выполнены Полученные за отчетный период важнейшие результаты: Для выполнения поставленных задач были проведены экспедиционные поездки в Бурятию (Муйский, Джидинский и Баргузинский р-ны - 2007 г), Амурскую (Еврейская А.О. - 2008 г.) и Сахалинскую (Охинский р-н - 2007) области, Хабаровский край (р-ны: Солнечный - 2006 г, Полины Осипенко и Аяно-майский - 2008 г.) и Приморский край (Чугуевский - 2008 г., Находкинский - 2007 г. р-ны, о-в Стенина - 2006 г.). Получен материал из Ю. Кореи - 2006 г., Южного Урала - 2006 г., Читинской обл. - 2006-2008 гг. Из перечисленные регионов собран материал для зоологического, кариологического, аллозимного, молекулярно-генетического онализов от видов: A. peninsulae, A. agrarios, Sylvaemus flavicollis, S. uralensis, Microtus mujanensis, M. fortis, M. evoronensis, M. gregalis, M. hyperboreus, M. maximowiczii, M. sakhalinensis, M. oeconomus, M. mandarinus. Кариотипировано 69 грызунов 6-ти видов животных в полевых и 172 в лабораторных условиях. Приготовлена зоологическая и цитологическая коллекция. Проведен молекулярно-генетический анализ (Cit b mt ДНК) 6 видов родов Microtus M. mujanensis, M. maximowiczii, M. fortis, M. oeconomus, M. sakhalinensis, M. evoronensis и 4-х видов рода Apodemus: A. agrarius, A. peninsulae. Исследование видов серых полевок Microtus. Проведен анализ хромосомной, аллозимной и морфологической изменчивости материковых и островных популяций M. fortis юга Дальнего Востока, что позволило проследить микроэволюционные процессы в островных изолированных популяциях с различным временем изоляции (Шереметьева и др., 2006). Впервые исследована межвидовая дифференциация 4 видов серых полевок - Microtus oeconomus, M. fortis, M. maximowiczii и M. sachalinensis Дальнего Востока России по аллозимным и хромосомным характеристикам. Морфологически близкие, но кариотипически различающиеся виды обладают значимым уровнем внутривидовой и межвидовой аллозимной дифференциации, причем она увеличивается в ряду: смежные популяции - пространственно разобщенные популяции - виды. Внутривидовая географическая аллозимная дифференциация цитогенетически полиморфного вида M. maximowiczii не всегда согласуется с хромосомной. По аллозимной дифференциации, хромосомным характеристикам, а также по морфологическим и молекулярно-генетическим особенностям краевой восточный подвид M. maximowiczii gromovi имеет значимые отличия, соответствующие видовому уровню различий в роде Microtus. Проведен анализ хромосомной и аллозимной изменчивости видов полевок группы видов "maximowiczii". Данные хромосомного анализа полевок M. maximowiczii из 40 выборок 36 локальных популяций по собственным и литературным данным позволили дополнить кариологические характеристики вида, описать каритипы полевок для ранее не исследованных точек (Картавцева и др., 2007), показать характер стабилизации хромосомных перестроек в различных географических регионах, впервые описать популяцию со стабилизировавшимся кариотипом (2n=42) в Читинской области (Kartavtseva et al., 2008) и выделить пять хромосомных форм (Kartavtseva et al., в печати план 2009). Полученные результаты позволяют предположить, что процессы накопления хромосомного и аллозимного разнообразия внутри M. maximowiczii были обеспечены в большой степени сложной структурой видового ареала и высокой значимостью генетико-автоматических процессов в популяциях с ограниченной численностью. На основании результатов комплекса морфологических и кариологических, а также аллозимных методов подтверждена видовая самостоятельность полевок окрестностей пос. Аян (Охотское побережье), ранее относимых к Microtus maximowiczii gromovi Vorontsov et al., 1988. (Sheremetyeva et al., 2008; Frisman et al., 2008 a, b; Фрисман Л.В. и др. в печати, план 2009). Проведен анализ хромосомной и морфологической изменчивости полевки Максимовича на террритории России, в результате чего дан диагноз нового вида Microtus gromovi stat. nov. (Sheremetyeva et al., in press, план 2009). Использование метода кариологического анализа позволило диагностировать виды-двойники серых полевок в Хабаровском крае и отнести полевок, отловленных нами в окрестностях пос. Нелькан, к виду M. hyperboreus. Таким образом, удалось расширить область распространение вида, т.к. это место расположено примерно в 1000 км на юг от ранее известной южной точки ареала. Полевок, отловленных в месте слияния рек Амгунь и Нимелен, Эворон-Чукчагырской впадины близ пос. имени Полины Осипенко Хабаровского края стало возможным отнести к виду M. evoronensis. Это место отлова эворонской полевки расположено на 250 км севернее от ранее кариотипированной точки этого вида (Шереметьева и др. в печати). Исследование видов лесных и полевых мышей группы "Apodemus" Данные сравнительного анализа С-окраски и FISH кариотипов малой лесной мыши Sylvaemus uralensis из различных популяций европейской и азиатской рас позволили выделить в азиатской расе новый вариант кариоморфы (Kartavtseva, Kolcheva., 2008). Анализ флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) прицентромерных районов восточноазиатской мыши на хромосомы других видов рода Apodemus позволил предположить различный состав прицентромерной ДНК A. peninsulae с одной стороны и A. argenteus и Sylvaemus flavicollis - с другой. Исследование кариотипов восточноазиатской мыши Apodemus peninsulae, проведенного впервые, для популяций Муйской долины и Баргузинской котловины в Бурятии позволили показать отсутствие добавочных хромосом точечных размеров. Данная характеристика кариотипа характерна для мышей Дальнего Востока, а не Забайкалья и Сибири. Впервые проведен FISH анализ добавочных хромосом A. peninsulae из популяций Японии и Кореи. Показаны особенности ДНК В-хромосом в исследованных популяциях. Для полевой мыши A. agrarius получены данные цитохрома в мт ДНК из различных популяций Евразии и показаны возможные пути расселения вида (Sakka et al., 2007). Впервые получены районоспецифичные ДНК-пробы В-хромосом и прицентромерных районов А-хромосом A. peninsulae для сравнительного FISH-анализа с хромосомами мышей A. peninsulae из ранее не исследованных популяций Сибири и Дальнего Востока (включая популяции островов Хоккайдо и Сахалин), а так же для сравнения с хромосомами других видов родов Apodemus и Sylvaemus. Полученные данные позволяю показать роль прицентромерных районов в эволюции видов родов Apodemus и Sylvaemus. Apodemus peninsulae. Проведен цитогенетический анализ мышей из популяций Сибири и Дальнего Востока России, Кореи и Японии с помощью методов рутинного и дифференциального окрашивания хромосом, получена кратковременная культура ткани и хромосомные препараты мышей островов Стенина и Сахалин. В период с 2006 по 2008 гг. отловлено и кариотипированы мыши из популяций Приморского края (о-в Стенина, окр. пос. Анисимовка, окр. пос. Авангард, Уссурийский стационар Чугуевского р-на), Хабаровского края (окр. пос. Эворон, окр. пос. Полины Осипенко, 8 км. с-в. от г. Хабаровск), Еврейская АО (окр. г. Биробиджан), Амурская обл. (Норский заповедник, окр. пос. Архара), Бурятия (окр. пос. Баргузин, окр. пос. Ошурково, окр. пос. Таксимо), Сахалинской обл. (дельта р. Лангри, перешеек п-ова Шмидта). Исследован мозаицизм восточноазиатской мыши Apodemus peninsulae (n = 345) из 41 точки отлова Дальнего Востока России. Полиморфизм по В-хромосомам выявлен у большей части особей (87.5 %). В данном регионе обнаружены как животные со стабильными кариотипами: без В- (12.5 %) и с В-хромосомами (26.1 %), так и особи-мозаики (61.4 %). Вариации чисел В-хромосом составили: от 0 до 4 – у животных со стабильными кариотипами и 0 до 7 - у особей-мозаиков. Индекс хВ у мышей Дальнего Востока России был 1.65, а в разных популяциях изменялся от 0 до 4. В клетках двух групп мышей - со стабильными и мозаичными кариотипами - были различные преобладающие числа хромосом, которые отличались и в популяциях разных географических регионов. Особи-мозаики имели от 2 до 5 клеточных клонов, и преобладали животные с 1, 2 и 3 клонами клеток. По-видимому, распределение мышей со сходными вариантами клонов в дальневосточных популяциях вида имеет хаотичный характер. В сданных в печать работах отражены вышеприведенные данные и обсуждается значимость для вида высокой частоты встречаемости особей с В-хромосомами. Выдвинуто предположение, что сложная картина варьирования чисел В-хромосом в геноме восточноазиатской мыши во многом носит стохастический характер, а система В-хромосом у вида остается, по-видимому, несбалансированной. Впервые проанализированы все имеющиеся варианты клонов для дальневосточных мышей, в результате чего обнаружено 76 вариантов клонов, различающихся по числу, размерам и морфологии В-хромосом. Выявлено, что сочетания вариантов клонов и их процентные соотношения часто оказывались уникальными. У животных со стабильными кариотипами (n = 133) описано 22 варианта клонов. Наибольшее разнообразие вариантов клеточных клонов (до 74) отмечено в группе особей-мозаиков, которую мы разделили на две подгруппы. В первой подгруппе (n = 87), где был один доминирующий клон, выявлено 65 вариантов сочетаний клонов. В другой подгруппе (n = 125), где доминирующих клонов было 2 и более, найдено 100 вариантов сочетаний клонов. У 67 % мышей из группы особей-мозаиков в наибольших количественных пропорциях выявлено 5 из доминирующих вариантов клонов, в которых найдены 0 В-хромосом и 1-2 метацентрические В-хромосомы мелких и средних размеров. Установлено оптимальное число хромосом (50), при котором выявлена зависимость между преобладанием животных и большому количеству вариантов клонов с В-хромосомами (Roslik, Kartavtseva, 2008; Рослик, Картавцева - сообщ. 1 и 2 в печати). Проведен анализ полученных хромосомоспецифичных и районоспецифичных ДНК-проб В-хромосом и прицентромерных районов А хромосом, в кариотипах мышей из различных популяций. Анализ флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) В хромосом мышей Сахалина, полученных из длительной культуры клеток, имеющих триплоидный набор хромосом и материка позволил показать, что ДНК В-хромосом (получено от мышей материковых популяций) может находится в теломерном районе одной из аутосом средних размеров и в прицентромерном районе половых (X, Y) хромосом мышей сахалинских популяций (до настоящего времени В-хромосомы в этих популяциях не зарегистрированы, но потенциально их появление не исключено). Получены В-хромосомы и из культуры клеток мышей о-ва Стенина. Анализ флуоресцентной in situ гибридизации не дал однозначных результатов и нуждается в дальнейшем исследовании. Методы и подходы, использованные в ходе выполнения проекта (описать, уделив особое внимание степени оригинальности и новизны): В ходе работы привлечены кариологические, аллозимные, молекулярно-генетические и традиционные зоологические методы исследований. Оригинальность и новизна данного исследования в применении комплексного анализа генетических и зоологических методов к изучению эволюции кариотипов, горячих точек хромосом у хромосомнор-полиморфных видов из природных популяций, имеющих различные типы хромосомной изменчивости (робертсоноские перестройки, инверсии, транслокации, дупликации, делеции и амплификации). Данные методы позволят проследить сопряженность кариологической, молекулярной и морфологической микро- и макроэволюции в исследуемых видах грызунов. Впервые исследована локализация прицентромерных повторов ДНК аутосом как в В-хромосомах восточноазиатской мыши из популяций различных регионов, так и у видов рода Apodemus. Цитогенетический подход включает традиционные и современные методы цитогенетики: дифференциальное окрашивание хромосом: DAPI, GTG, С-, Ag-NOR окрашивание хромосом (по Seabright, 1971; Bloom, Goodpasture, 1976; Verma, Babu, 1995, Sumner, 1972; Графодатский, Раджабли, 1988); флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH) и детекцию меченых ДНК-проб (Pinkel et al., 1986). Для определения локализации исследуемых районов хромосом использована микродиссекция как целых, так и участков А и В хромосом. Амплификация геномной ДНК с помощью DOP-PCR проводена с праймером MW6 (Telenius et al., 1992), с модификацией (Rubtsov et al., 2000). Разделение белков проводили в крахмальном геле по стандартной методике (Корочкин и др., 1977; Алтухов, 1985). Метод молекулярно-генетического анализа мтДНК, проведен в лабораториях БПИ ДВО РАН, Австрии и Японии при участии исполнителей данного проекта. Морфометрический анализ проведен с целью выяснения сопряженности хромосомной морфологической, аллозимной и молекулярно-генетической внутривидовой изменчивости исследуемых видов. Все перечисленные подходы достаточно современны, ряд из них поставлен лишь в нескольких лабораториях страны. Для всех методик используются разработанные нами модификации. Степень новизны полученных результатов: Большая часть полученных результатов нова. Сопоставление полученных результатов с мировым уровнем: Количество научных работ, опубликованных в ходе выполнения проекта: 19 Количество научных работ, подготовленных в ходе выполнения проекта и принятых к печати в 2008 г.: 4 Адреса ресурсов в Internet, подготовленных авторами по данному проекту: нет Библиографический список всех публикаций по проекту: Kartavtseva I.V., Kolcheva N.E. 2008. Chromosomal Definition of the Wood mice Sylvaemus from Middle Ural // 11th International Conference Rodens et Spatiun on Rodent Biology. - Myshkin. P. 75. Roslik G.V. Kartavtseva I.V. Mosaicism caused by B chromosomes variability, in the Korean fild mouse Apodemus peninsulae (Rodentia) // 11th International Conference Rodens et Spatiun on Rodent Biology. - Myshkin. P. 59. P. 48. Sheremetyeva I., Kartavtseva I., Haring E., Frisman L., Kryukov A. 2008. Morphological and genetic characteristics of Microtus maximowiczii gromovi Vorontsov, Boeskorov, Lyapunova et Revin, 1988 // 11th International Conference Rodens et Spatiun on Rodent Biology. - Myshkin. P. 84. Frisman L., Kartavtseva I., Korobitsyna K., Sheremetyeva I. 2008. Grey voles (MICROTUS Schrank, 1798) of Russian Far East: geographical or chromosomal speciation model // 11th International Conference Rodens et Spatiun on Rodent Biology. - Myshkin. P. 71. 2008. Chromosomal polymorphism of Microtus maximowiczii (Rodentia, Cricetidae) in population from the Russian Far East // XX international congress of genetics Berlin, Germany. P. 269-270. Фрисман Л. В., Коробицына К. В., Картавцева И. В., Шереметьева И. Н., Войта Л. Л.. Серые полевки (Microtus Shrank, 1798) Дальнего Востока России: аллозимная и кариологическая дивергенция. Генетика, в печати, план 2009 г. Sheremetyeva I. N., Kartavtseva I. V., Voyta L. L., Kryukov A. P. and Haring E./ Morphometric analysis of intraspecific variation in Microtus maximowiczii(Rodentia, Cricetidae) in relation to chromosomal differentiation with reinstatementof Microtus gromovi Vorontsov, Boeskorov, Lyapunova et Revin, 1988, stat. nov.// J Zool Syst Evol Res N? 2009. Kartavtseva Irina V., Sheremetyeva Irina N., Korobitsina Kira V., Nemkova Galina A., Konovalova Elena V., Korablev Vladimir V., Voyta Leonid L. Chromosomal polymorphism of Microtus maximowiczii Schrenck, 1858 (Rodentia, Cricetidae): 2n and NF in different geographic regions // Russian Journal of Theriology, N ...2009. Картавцева И.В., Шереметьева И.Н., Немкова Г.Е., Лазурченко Е.В. 2007.Хромосомные исследования полевки Максимовича Microtus maximowiczii Schrenk, 1858 в Норском заповеднике Амурской области и эворонской Microtus evoronensis Kovalsk. et Socolov, 1980 окрестностей озера Эворон Хабаровского края // Териофауна России и сопредельных территорий. Мат-лы межд. Сов. 31 января-2 февраля 2007 г. Москва, 2007. КМК. C. 188. Колчева Н.Е. Численность, репродукция и возрастная структура популяций малой лесной мыши в различных экологических условиях // Млекопитающие горных территорий. Тов-во научн. изданий КМК. М.: 2007. С. 164-169. Крюков А.П., Журавлев Ю.Н., Реунова Г.Д., Картавцева И.В., Фрисман Л.В., Музарок Т.И., Артюкова Е.В., Козыренко М.М., Корень О.Г., Холина А.Б., Шереметьева И.Н., Спиридонова Л.Н., Челомина Г.Н., Кац И.Л., Лёвина Е.А., Адрианова И.Ю., Наконечная О.В. Генетические процессы в природных популяциях ценных, редких и модельных видов растений и животных Российского Дальнего Востока // Программа фундаментальных исследований Президиума РАН № 11 "Биоразнообразие и динамика генофондов". Подпрограмма II "Динамика генофондов". Сб. материалов. М: ФИАН, 2006/7. С. 43-45. Michaux Johan, Pavlenko Marina, Kartavtseva Irina, Catteau Gilles, Sakka Hela, Quere jean-Pierre, Chelomina Galina, Bogdanov Aleksey, Hang Lee, Neumann Karsten Mitochondrial phylogeography of the striped field mouse (Apodemus agrarius) throughout the Palaearctic region. Hystrix. The Italian Journal of Mammology (N.S.) Vol. I-II, Supp. 2007. p. 128. Héla Sakka, Jean-Pierre Quere, Marina Pavlenko, Irina Kartavtseva, Lee Hang, Mohamed Marrakchi, Johan Michaux. 2007. Mitochondrial phylogeography of six Apodemus species in Far East Russia and China. Hystrix. The Italian Journal of Mammology (N.S.) Vol. I-II, Supp. p. 162. Kartavtseva I.V. Problems of chromosomal researches mammal from natural populations of the Far East of Russia // Hystrix. The Italian Journ. of Mammology (N.S.) Vol. I-II, Suppl. 2007. P. 543. Kartavtseva Irina "Chromosomal researches of mammal from natural populations of the Russian Far East". International symposium MAPEG-07 (Nodern achievements in population, evolutionary and ecological genetics). Vladivostok - Vostok Marine Biological Station September 9-14. 2007. p. 17. Шереметьева И.Н., Картавцева И.В., Челомина Г.Н. 2007. Микроэволюционные процессы в островных популяциях дальневосточной полевки Microtus fortis Büchner, 1889: данные морфологического, кариологического, аллозимного и молекулярно-генетического анализов // Современные проблемы биологической эволюции. К 100 летию Дарвиновского музея 17-20 сентября, 2007, г. Москва. - М., ГДМ. С. 133. Sheremetyeva I.N., Kartavtseva I.V., Chelomina G.N. 2007. Variation in island populations of Far Eastern voles, Microtus fortis Buchner, 1889 (Rodentia, Cricetidae): dates morphological, karyological, allozyme and molecular genetic analyses. // MAPEG-07 (Nodern achievements in population, evolutionary and ecological genetics). Vladivostok - Vostok Marine Biological Station September 9-14. 2007. P. 36. Шереметьева И.Н. 2007. Географическая изменчивость краниометрических параметров дальневосточной полевки, Microtus fortis (RODENTIA, CRICETIDAE) // Зоол. журн. - Т. 86. №. 6. С. 751-760. Chelomina G.N. & Sheremetyeva I.N. Genetic variation of Microtus fortis pelliceus in mainland and island populations of the Russian Far East based on random amplified polymorphic DNA markers // Mammal Study. 2007.- Vol. 32. P. 63-74. принята в печать план 2009) Correlation of allozymic and karyotype differentiation as a test of the chromosomal model of speciation // XX international congress of genetics Berlin, Germany. P. 234. Картавцева И.В. Хромосомная изменчивость и проблемы кариосистематики млекопитающих // Хромосомы и эволюция. СПб.: КМК. С. 56-57. Участие в научных конференциях и совещаниях по тематике проекта, которые проводились при финансовой поддержке РФФИ: 4 Участие в экспедициях по тематике проекта, проводимых при финансовой поддержке РФФИ: 2 Финансовые средства, полученные от РФФИ: 840000 руб Дорогостоящие вычислительная техника и научное оборудование, приобретенные на средства Фонда: нет
