# 建库测序及数据质控报告

合同编号 | H101SC24090344
合同名称 | （极速周期）北大SH自建库散样XP建库测序技术服务（委托）合同
分期编号 | X101SC24090344-Z01-J108
报告时间 | 2025-03-12
售后服务电话 | 400-658-1585
售后服务邮箱 | service-ls@novogene.com

## 1 建库测序流程

从接受客户文库到获得最终测序数据，其中文库检测、上机测序等每一个环节都会对测序数据的质量和数量产生影响。诺禾致源对每一个生产环节都严格把控。对于客户自建库文库类型，在上机测序之前会进行严格文库质量检测并出具相关库检报告，从而确保产出高质量的数据。流程图如下:

### 1.1 文库检测

诺禾致源对客户文库的检测主要包括3种方法：

(1) Qubit检测对文库浓度进行初步定量。

(2)AATI检测文库片段的完整性及插入片段大小。

(3) QPCR检测文库有效浓度。

### 1.2 上机测序

文库检测合格后，按照有效浓度及目标下机数据量的需求将不同文库pooling至flowcell后，使用Illumina高通量测序平台进行测序。

## 2 结果展示及说明

### 2.1 测序数据格式简介

Illumina高通量测序仪测序得到的原始文件是图像文件，在进行碱基识别（base calling）和Bcl2Fastq转化后，即可得到FASTQ（简称fq）格式的原始测序序列（sequenced reads），称之为raw data或raw reads。FASTQ格式的数据中含测序序列（reads）的序列信息以及其对应的测序质量信息，其中每条reads均由四行组成(Cock P.J.A. et al. 2010)，示例如下：

@HWI-ST1276:71:C1162ACXX:1:1101:1208:2458 1:N:0:CGATGT
NAAGAACACGTTCGGTCACCTCAGCACACTTGTGAATGTCATGGGATCCAT
+
#55???BBBBB?BA@DEEFFCFFHHFFCFFHHHHHHHFAE0ECFFD/AEHH

第一行是序列标识（read ID）以及相关的描述信息，以“@” 开头；

第二行即为碱基序列，长度由测序策略决定；

第三行以“+”开头，后面是序列标示符、描述信息，或者什么也不加；

第四行是测序质量值（phred），与第二行一一对应，phred值以ASCII码标记，对应的 ASCII 值减去33，即为第二行对应碱基的测序质量值。

Illumina测序标识详细信息如下：

HWI-ST1276 | Instrument – unique identifier of the sequencer
71 | run number – Run number on instrument
C1162ACXX | FlowCell ID – ID of flowcell
1 | LaneNumber – positive integer
1101 | TileNumber – positive integer
1208 | X – x coordinate of the spot. Integer which can be negative
2458 | Y – y coordinate of the spot. Integer which can be negative
1 | ReadNumber - 1 for single reads; 1 or 2 for paired ends
N | whether it is filtered - NB：Y if the read is filtered out, not in the delivered fastq file, N otherwise
0 | control number - 0 when none of the control bits are on, otherwise it is an even number
CGATGT | Illumina index sequences

### 2.2 关于测序数据相关的说明

(1) 交付的数据为fastq（简称fq）格式文件的压缩包，文件名后缀通常为 “.fq.gz”。交付数据前我们会计算每个压缩文件的md5值。在您拿到数据之后，请您先校>验每个压缩文件的md5值，Linux下可以在数据目录使用“md5sum -c <*md5.txt>”命令进行校验，Windows下可使用hashmyfiles等校验工具，如发现压缩文件md5值与附在数据文件目录下的md5文档中的不一致则说明文件可能在传输的过程中被损坏。

(2) 对于双端（PE）测序，每个样品的数据均有对应PE测序的read1和read2的两个文件，两个文件的行数应该一致，您可以在Linux下使用“zcat XXX.fq.gz | wc -l”命令检查数据文件的行数，行数除以4即为reads的数量。

(3) 数据文件大小为文件占用磁盘空间的大小，文件的大小通常与磁盘格式、压缩比例等因素有关，与测序数据量（碱基数）的多少无对应关系，因此对应PE测序的 read1和read2两个文件大小也可能不相同。

(4) 部分项目单个样品测序数据量较大（如基因组），采用分lane上机策略以保证产出数据的质量，因此单个样品可以对应多对数据文件。如样品1有sample1_L1_1.fq.gz和sample1_L2_1.fq.gz两个read1文件，这表明该样品分lane上机，产出自lane1和lane2。

(5) 关于质控标准。如果承诺交付clean data数据，数据过滤标准：当任一测序read中N含量超过该read碱基数的10%时，去除此paired reads；当任一测序read中含有的低质量（Q<=5）碱基数超过该条read碱基数的50%时，去除此paired reads。更多文章参考诺禾致源官网：www.novogene.com。

质控参数：fastp -G (禁用polyG尾部修剪) -A (禁用adapter过滤) -g (polyG尾 trim) -q 5（低质量判断阈值）-u 50（低质量比例阈值）-n 15（N 长度阈值）-l 150 --overlap_diff_limit 1 --overlap_diff_percent_limit 10；软件：fastp （version 0.23.1）

(6) 关于测序reads。除去声明的部分特殊类型，我们使用的index通常处于adapter中间，在测序中由index read完成，由此测序得到的read1和read2的各个碱基全都是样本的序列，后续进行mapping或组装等分析时，头尾不需要再做处理。

(7) 数据免费保存期为30天（从交付数据第二天开始计算），请您收到数据后，及时核查数据是否有问题。

### 2.3 测序数据质量评估

#### 2.3.1 测序质量分布检查

如果测序错误率用e表示， 平台测得数据的碱基质量值用Qphred表示，则有：Qphred=-10log10(e)。软件中碱基识别正确率与Phred分值之间的简明对应关系见下表：

Phred分值 | 不正确的碱基识别 | 碱基正确识别率 | Q-score
--- | --- | --- | ---
10 | 1/10 | 90% | Q10
20 | 1/100 | 99% | Q20
30 | 1/1000 | 99.9% | Q30
40 | 1/10000 | 99.99% | Q40

本项目测序碱基质量情况见 图 1:

PPO-11 PPO-13 PPO-2 PPO-12

图1 测序质量分布图

横坐标为reads的碱基位置，纵坐标为单碱基质量值
前半部分为双端测序序列的第一端测序reads的质量分布情况，后半部分为另一端测序reads的质量分布情况

### 2.4 测序数据质量情况汇总

本次共4个样本，测序产出Raw data共202.38 G，过滤后的Clean data共202.37 G。

样品测序产出数据质量评估情况详见 表1.

表1 数据产出质量情况一览表

Sample | Library Name | Raw Reads | Clean Reads | Raw Base(G) | Clean Base(G) | Effective(%) | Error(%) | Q20(%) | Q30(%) | GC(%)
--- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | ---
PPO-11 | FKDL250025859-1a | 229048066 | 229047910 | 34.36 | 34.36 | 100.00 | 0.01 | 97.97 | 93.40 | 45.21
PPO-13 | FKDL250025857-1a | 331843808 | 331841854 | 49.78 | 49.78 | 100.00 | 0.01 | 97.98 | 94.73 | 43.95
PPO-2 | FKDL250025856-1a | 332955358 | 332952896 | 49.94 | 49.94 | 100.00 | 0.01 | 98.63 | 95.83 | 42.57
PPO-12 | FKDL250025858-1a | 455321394 | 455319556 | 68.30 | 68.30 | 100.00 | 0.01 | 98.73 | 96.09 | 42.71

Sample: 样品名
Raw reads：测序Raw reads的数量
Clean reads：过滤后获得的Clean reads 数量
Raw bases：测序原始数据的总碱基数，即为Raw reads数量乘以测序长度算得，以G为单位
Clean bases：过滤后数据的总碱基数，以G为单位
Effective: (Clean reads/Raw reads)*100%
Error：平均碱基测序错误率
Q20、Q30：Phred 数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比
GC：GC碱基数占总碱基数量的百分比

## 3 附录

### 3.1 参考文献

Cock PJ, Fields CJ, Goto N, Heuer ML, Rice PM. The Sanger FASTQ file format for sequences with quality scores, and the Solexa/Illumina FASTQ variants. Nucleic Acids Res. 2010;38(6):1767-1771. doi:10.1093/nar/gkp1137.
Chen S, Zhou Y, Chen Y, Gu J. fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 2018;34(17):i884-i890. doi:10.1093/bioinformatics/bty560.
Erlich Y, Mitra PP, delaBastide M, McCombie WR, Hannon GJ. Alta-Cyclic: a self-optimizing base caller for next-generation sequencing. Nat Methods. 2008;5(8):679-682. doi:10.1038/nmeth.1230
Hansen KD, Brenner SE, Dudoit S. Biases in Illumina transcriptome sequencing caused by random hexamer priming. Nucleic Acids Res. 2010;38(12):e131. doi:10.1093/nar/gkq224
Jiang L, Schlesinger F, Davis CA, et al. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 2011;21(9):1543-1551. doi:10.1101/gr.121095.111